做过药品或化妆品微生物检测的人大概没有不认识白色念珠菌的。ATCC 10231这株菌在行业里的地位很特殊——它是目前各国药典和ISO标准中唯一被共同指定的酵母类标准菌株。无论是做防腐效力挑战试验、微生物计数法验证还是控制菌检查它都是绕不开的角色。本文结合笔者多年实验室工作经验系统梳理这株菌的核心技术要点希望对同行有所帮助。菌株基本信息ATCC 10231的分类学全名为 Candida albicans (Robin) Berkhout属于子囊菌门念珠菌属。该菌株的宿主来源记录为人源最初从临床标本中分离获得。根据ATCC官方标注其生物安全等级为BSL-1但由于白色念珠菌本身具有条件致病性部分机构在实际管理中将其按BSL-2级别对待这一做法在行业内并不罕见。采购时通常以获得冻干安瓿形式交付复溶后即可使用。生物学特性与形态在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)平板上25°C培养48-72小时后ATCC 10231形成的菌落呈乳白色至奶油色表面光滑湿润边缘整齐略微隆起呈凸面状具有典型的酵母菌落特征。显微镜下观察为卵圆形出芽酵母细胞大小约4-6微米偶见假菌丝形成。假菌丝的出现与培养条件和传代次数有关这一点在实际操作中需要格外留意。芽管试验是白色念珠菌鉴定中最经典的生化试验之一。将菌悬液接种于灭活血清中37°C孵育2-3小时后镜检可见从酵母细胞表面伸出管状芽管这是白色念珠菌区别于其他念珠菌种的重要依据。ATCC 10231的芽管试验结果为阳性反应典型且稳定这也是它被选为标准菌株的原因之一。培养条件与操作要点日常培养推荐使用SDA或YM肉汤(酵母浸膏麦芽汁培养基)PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)也可作为替代选择。常规培养和传代的适宜温度为20-25°C一般48-72小时即可获得充分的菌落生长。但在某些药典试验中——例如抑菌效力检查法中的接种培养或者芽管试验——需要将培养温度调整至35-37°C。有一点值得注意同一株菌在25°C和37°C下的形态表现可能不同。温度偏高时更容易诱导假菌丝和菌丝体形成这会给后续的菌落计数和菌悬液制备带来麻烦。笔者的经验是日常传代和菌悬液制备尽量在25°C下操作只在药典试验明确要求的环节才升温至37°C。另外SDA配制时pH应调至约5.6这对抑制细菌污染和促进酵母生长都有好处。在各药典及标准中的应用美国药典(USP)中的应用USP 51 Antimicrobial Effectiveness Testing中白色念珠菌作为酵母类代表菌被纳入防腐效力挑战试验的接种菌群用于评估药品和化妆品中防腐体系对真菌的抑制能力。USP 61 Microbial Enumeration Tests中该菌用于酵母菌和霉菌计数方法的验证。USP 62 Tests for Specified Microorganisms同样涉及白色念珠菌的相关检测要求。可以说在USP微生物学章节中ATCC 10231的出镜率非常高。欧洲药典(EP)中的应用欧洲药典对白色念珠菌的使用要求与USP基本一致。EP 2.6.12和2.6.13分别规定了非无菌产品的微生物计数法和特定微生物检查法中该菌的应用。EP 5.1.3和5.1.4则涉及抑菌效力评价相关内容。做出口欧盟产品的企业在方法验证时通常需要同时满足EP和USP的双重要求。中国药典中的应用《中国药典》2020年版四部通则中白色念珠菌出现在多个章节。通则1105(微生物计数法)中将其列为酵母菌和霉菌计数的代表菌种用于培养基适用性检查和方法验证。通则1106(控制菌检查法)和1107涉及特定微生物的检测。通则1121(抑菌效力检查法)中白色念珠菌是挑战试验中唯一指定的酵母类标准菌株。在国内药品生产企业中这株菌的使用频率可能是所有真菌标准株中最高的。消毒技术规范与国标中的应用卫生部《消毒技术规范》(2002年版)中白色念珠菌被用于消毒剂对真菌杀灭效力的鉴定试验是评价消毒产品抗真菌效果的核心指标菌。GB 15979《一次性使用卫生用品卫生标准》中同样涉及白色念珠菌的抗真菌检测要求。做消毒产品备案或卫生用品检测的实验室ATCC 10231基本是常备菌种。ISO国际标准中的应用ISO 11930规定了化妆品抗真菌防腐效力的评价方法白色念珠菌是其中的标准测试菌株之一。ISO 16212则专门针对化妆品的抗真菌效力测试做出了规定。随着国内化妆品法规体系逐步与国际接轨越来越多的化妆品企业开始按照ISO标准进行防腐挑战试验ATCC 10231的需求量也在持续增长。在行业质控中的典型用途除了上述药典和标准中明确规定的用途之外ATCC 10231在日常质控工作中还有不少应用场景。比如新批次培养基(如SDA、玫瑰红钠琼脂等)到货后实验室通常会用这株菌做生长促性试验来验收。又比如在进行环境监测方法确认时白色念珠菌可作为真菌回收率的参照。抗真菌药物的药敏试验、消毒剂的杀真菌效力评估、防腐体系的配方筛选都离不开这株菌。菌种保藏与传代管理菌种管理是标准菌株使用中最容易被忽视却又最关键的环节。ATCC 10231的冻干品应保存于2-8°C冰箱中避免反复温度波动。开启后如需长期保藏推荐制备甘油冻存管保存于-80°C每管分装适量用时取出一管即可。短期使用可制备SDA斜面2-8°C保存但建议不超过一个月。这里要特别强调一点白色念珠菌不宜反复传代。过多传代会导致菌株的形态和生理特性发生漂移最典型的表现就是假菌丝形成能力改变、芽管试验反应减弱甚至菌落形态变异。笔者的做法是从冻存管复苏后制备工作菌株控制传代不超过5代并建立完整的菌种使用记录台账。如果条件允许建议直接购买商业化的定量菌片或即用型菌悬液可以最大程度减少传代带来的不确定性。操作安全与注意事项虽然ATCC将白色念珠菌标注为BSL-1级别但操作时仍应按照良好的微生物学操作规范进行。白色念珠菌是已知的人体条件致病菌可引起口腔、皮肤及黏膜感染免疫力低下人群尤其需要注意。建议在生物安全柜中进行所有涉及活菌的操作操作者穿戴实验服、手套和护目镜。废弃的含菌培养物和耗材须经121°C高压灭菌至少30分钟后方可丢弃。工作台面在操作完成后用75%乙醇或适宜的消毒剂彻底擦拭。另外部分地方性法规或机构内部规程可能要求按BSL-2标准管理白色念珠菌实验前应确认所在机构的具体要求不可一概而论。常见问题与工程师建议假菌丝干扰计数怎么办白色念珠菌在平板上形成假菌丝后菌落可能呈蔓延状生长给计数造成困难。对策是尽量缩短培养时间至48小时以内避免过度培养也可以尝试在培养基中添加适量氯霉素或庆大霉素抑制细菌的同时通过控制培养温度(25°C)来减少假菌丝的形成。芽管试验结果不稳定血清质量是关键因素。务必使用灭活的新生牛血清或人血清且血清不能反复冻融。另外菌悬液的浓度不宜过高接种量过大会影响芽管的观察和判读。菌悬液浓度总是不够白色念珠菌在SDA斜面上的生长量通常足够制备菌悬液。如果浓度偏低可以延长斜面培养时间至72小时或者改用液体培养基(YM肉汤)振荡培养后收集菌体。制备菌悬液时使用含吐温80的生理盐水有助于菌体均匀分散。从冻干管复苏失败冻干菌种的复苏需要注意两点一是复溶时动作要轻柔避免剧烈吹打损伤细胞二是复溶后应尽快转接到新鲜培养基上不宜长时间放置。首次复苏建议在SDA平板和SDA斜面上同时接种以提高成功率。关于杭州康氧医疗器械有限公司杭州康氧医疗器械有限公司专注于微生物标准菌株、ATCC菌株及相关质控产品的供应与技术服务致力于为制药企业、食品检测机构和科研院所提供可靠的微生物质控解决方案。如需了解ATCC标准菌株产品信息或技术支持欢迎联系我们官网kystrains。免责声明本文所述菌株信息及技术参数均来源于ATCC官网、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、《中国药典》2020年版、ISO国际标准及《消毒技术规范》等公开权威资料仅供专业技术参考。具体实验操作请以产品随附的质检报告(COA)和说明书为准并严格遵守所在机构的生物安全管理制度。本文不构成任何产品推荐或使用建议。关键词标签:ATCC 10231, 白色念珠菌, Candida albicans, 标准菌株, 酵母菌, 药典, 抗真菌, 微生物检测
