【问题引入】在抗体发现领域单B细胞分选技术已经发展为一项核心平台技术。其基本原理是利用每个B细胞只产生一种特异性抗体的特点直接从单个抗原特异性B细胞中扩增抗体基因再通过重组表达获得完整单克隆抗体。这一技术相较于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的核心优势在于保留了抗体天然配对的轻重链可变区序列不经过体外随机配对获得的重组抗体与体内产生的抗体在序列和功能上完全一致。当这一技术应用于具有独特抗体系统的牛时便构成了牛单B细胞单抗制备专有流程。2024年The Scripps Research Institute团队利用这一策略系统评估了不同形式HIV Env免疫原在牛体内的免疫原性下文将完整还原其实验路线。【技术路线分解】Step 1免疫方案设计研究者选择BG505毒株的SOSIP.664稳定三聚体和单体gp120作为免疫原。免疫原需经过严格的纯化——SOSIP三聚体通过亲和层析和尺寸排阻层析确保构象均质性排除非天然构象的聚集物或单体形式。Step 2免疫及样本采集牛只分别接种不同免疫原。在第0天进行初次免疫第21-28天进行首次加强后续继续加强免疫2-3次。每次免疫后采集外周血分离PBMCs通过密度梯度离心法获得单核细胞悬液。Step 3流式细胞术分选抗原特异性B细胞这是牛单B细胞单抗制备的枢纽环节。PBMCs经荧光标记抗牛IgM、抗牛CD21和荧光标记抗原探针染色后在流式细胞仪上设门分选首先圈出淋巴细胞门再排除死细胞筛选IgM⁻/CD21⁺记忆B细胞标志最后以荧光标记的抗原探针捕获抗原特异性B细胞。单个细胞被分选至含裂解液的96孔PCR板中。Step 4抗体重链和轻链基因的扩增分选板经短暂离心后进行反转录RT反应。采用巢式PCR策略第一轮PCR使用简并引物或家族特异性引物扩增牛抗体VH和VL基因第二轮PCR使用嵌套引物进一步富集产物并添加克隆用酶切位点。Step 5重组表达载体的构建与转染将扩增得到的VH和VL片段分别克隆至含牛IgG重链恒定区和轻链恒定区的真核表达载体pcDNA3.4中。质粒经测序验证碱基无误后共转染HEK-293T或CHO细胞。转染后5-7天收集上清通过蛋白G亲和层析纯化单克隆抗体。【关键实验结果与数据】抗体产量与结合活性从免疫三聚体的牛外周血中成功分离出多株抗原特异性单克隆抗体在ELISA中均表现出与BG505 SOSIP三聚体的特异性结合信号。中和活性其中靶向CD4结合位点的抗体和靶向V2-apex的抗体在TZM-bl细胞中和实验中对多株跨亚型的HIV假病毒展示出交叉中和能力。与之形成鲜明对比的是单体gp120免疫牛的血清和抗体在相同检测条件下完全未检测到跨亚型中和活性。结构数据X射线晶体学和负染电镜分析显示分离到的V2-apex靶向bnAbs的超长CDRH3形成了独特的茎stalk-knob结构knob结构突出于Fab表面可穿透Env的糖基化屏障深入结合到V2-apex区域的保守氨基酸残基上。【技术要点总结】牛单B细胞单抗制备之所以适合用于这一研究场景与牛抗体的超长CDRH3特性密不可分。常规抗体Fab片段上的抗原结合位点由6个CDR共同构成而牛超长CDRH3抗体的knob结构可以单独承担抗原识别功能对抗原表面的保守凹槽具有天然的结构偏好。正因如此在从免疫牛体内进行单B细胞分选和重组表达时富集出来的bnAbs具有更高概率靶向其他物种抗体难以触及的表位。参考文献Altman PX, et al. HIV envelope trimers and gp120 as immunogens to induce broadly neutralizing antibodies in cows. bioRxiv. 2024.Altman PX, et al. Immunization of cows with HIV envelope trimers generates broadly neutralizing antibodies to the V2-apex from the ultralong CDRH3 repertoire. PLoS Pathog. 2024.赵绮欢等. 牛抗体中超长CDR H3结构的研究进展. 黑龙江畜牧兽医. 2023.卡梅德生物. 单B细胞筛选平台. 单B细胞筛选平台_天津卡梅德科技发展有限公司于迪等. 牛抗体重链可变区超长CDRH3的形成机制及作用研究进展. 内蒙古大学学报. 2019.
