一、实操痛点提出双靶点筛选实验反复踩坑遮蔽肽筛选是前置必做步骤长期做免疫通路小分子筛选的实验人员都会遇到三类实操难题一是无遮蔽肽筛选先导指引直接开展上万分子 MST 筛选上机耗材、时间成本翻倍90% 分子仅单靶点弱结合二无法同步验证分子对两条通路的阻断效果单套细胞模型只能检测单一通路实验周期拉长一倍三分子体内活性与体外数据脱节大量体外亲和分子细胞层面无调控效果遮蔽肽筛选能从源头规避大部分无效实验遮蔽肽筛选也是整套筛选流程中不可省略的前置关键操作。 很多课题组省略遮蔽肽筛选步骤直接开展小分子库筛选最终筛选出的候选分子无双重结合能力浪费大量试剂耗材遮蔽肽筛选流程标准化后可提前锁定双靶共有结合区域大幅提升筛选命中率本次实操方案完整记录遮蔽肽筛选、MST、细胞验证全步骤所有参数可直接复用。二、实操问题分层解析筛选前置缺失问题不做遮蔽肽筛选无结合位点参考小分子筛选无靶向范围随机分子难以贴合两个蛋白平坦互作界面上机检测大量无效样本遮蔽肽筛选可快速锁定双靶共有氨基酸区域缩小筛选区间。MST 上机操作漏洞常规实验分两次检测两种靶蛋白无法同步获取双靶 KD 值无法快速判定双亲和分子依托遮蔽肽筛选得到的位点信息可统一设置检测缓冲液参数同步上机检测双蛋白。细胞模型单一缺陷仅构建单通路细胞共培养体系无法同步评估双重通路阻断带来的免疫因子变化遮蔽肽筛选得到的特征序列可构建双靶稳定工程细胞一套体系完成两条通路功能验证。三、标准化实操完整流程遮蔽肽筛选 筛选 验证模块 1 遮蔽筛选实操核心前置步骤遮蔽肽筛选核心操作文库构建十二肽噬菌体展示文库宿主菌 ER2738固相载体分别包被 hTIGIT、hPD-1 重组蛋白三轮正负遮蔽肽筛选第一轮阳性富集双靶结合噬菌体第二轮阴性筛除单靶结合杂噬菌体第三轮严格洗脱富集高亲和遮蔽肽单克隆测序挑取阳性噬菌斑测序纯化优势遮蔽肽开展 SPR 结合验证解析与双靶共有结合位点完成遮蔽肽筛选全部流程。模块 2 MST 微量热泳动小分子筛选依据遮蔽肽筛选解析的结合区域限定分子库范围缓冲液配比PBS0.05% Tween0.5% DMSO蛋白荧光标记 RED-NHS小分子设置 16 个浓度梯度上机同步检测 hTIGIT、hPD-1 两组 KD 值。模块 3 细胞通路阻断实验构建 CHO-K1-hPVR、CHO-K1-hPD-L1 稳定细胞株梯度稀释候选分子孵育流式检测配体结合 MFI 值计算通路阻断率模块 4 细胞因子功能验证Jurkat-hTIGITCHO-hPVR、JurkatCHO-hPD-L1 两套共培养模型200 nM 候选分子处理流式检测 IL-2 表达小鼠脾脏免疫细胞与 MC38 细胞共培养检测 CD8T 细胞 IFN-γ 分泌水平。模块 5 体内动物实验C57BL/6 小鼠皮下移植细胞分低 / 高剂量给药组、放射联合组每两日记录组织体积、体重取材检测免疫细胞浸润与脏器病理。四、实操直观实验数据遮蔽肽筛选实操结果三轮遮蔽肽筛选后阳性噬菌体富集倍数提升 420 倍得到 7 条双靶特异性遮蔽肽最优肽双靶 KD 均 1 μM依靠遮蔽肽筛选将待筛小分子数量缩减 72%耗材成本降低 65%。MST 上机数据Gln (TrT 双靶蛋白均达到微摩尔级亲和跨鼠源蛋白同样稳定结合单轮上机可同步完成双靶检测无需分两次操作。细胞阻断实验200 nM 浓度下两条通路阻断率均超 60%细胞 IL-2 分泌提升 3 倍高剂量体内组组织增殖显著受抑脏器无病理损伤。实操避坑总结遮蔽肽筛选每轮洗脱梯度严格把控洗脱强度过低会富集低特异性肽过高丢失高亲和遮蔽肽MST 缓冲液 DMSO 浓度不可超过 0.5%避免蛋白构象改变依托遮蔽肽筛选位点设置分子浓度梯度提升数据可靠性细胞共培养刺激时间固定 44 h过早收样会导致细胞因子检测数值偏低。参考文献李杨. TIGIT_PVR 和 PD-1_PD-L1 双靶向阻断剂的筛选及其活性研究 [D]. 郑州大学2024.
