引言天然产物靶点鉴定与基于单靶点设计的合成药物不同中药活性分子往往骨架复杂、官能团丰富。它们通常以多靶点、弱亲和力的模式起效这让其作用机制长期处于“黑匣子”状态。随着化学蛋白质组学与高通量质谱技术的深度融合中药靶点筛选已经形成了标记法与非标记法两大成熟技术体系。但在具体的课题设计阶段大家常常陷入纠结到底该选哪种技术为什么大家都觉得呼声很高的“非标记法”比传统的“标记法”更好今天这篇文章我们就来快速梳理这两大技术体系的核心逻辑并重点拆解四类典型科研场景的最优落地策略帮大家在实验设计阶段理清思路少走弯路。一、标记法vs非标记法差异究竟在哪靶点筛选技术的核心分野在于是否需要对天然活性分子进行化学结构修饰。为了方便大家快速判断我们对两者的核心差异进行了提炼① 标记法基于分子探针的直接捕获▶ 核心逻辑这是“主动改造、钓鱼取证”的过程。通过有机合成手段引入特定的追踪或富集基团将天然分子改造为功能化分子探针。▶代表技术包括经典的生物素-链霉亲和素Pull-down、保护天然构象的Strep-tag技术以及兼容活细胞内瞬态相互作用的光亲和标记PAL联合点击化学。▶优势能拿到直接结合的“硬核”证据有效过滤下游信号通路带来的背景噪音。▶局限入场门槛高高度依赖已知的构效关系。化学合成成本高且无法应用于天然丰度极低的珍稀成分。② 非标记法基于理化性质的原位侦测▶核心逻辑这是“原位观测、逆向推导”的过程。完全不对化合物进行化学修饰而是基于配体结合会改变蛋白特定理化性质如热力学稳定性、抗水解能力的定律反向推导靶蛋白。▶代表技术分为基于水解稳定性的技术如DARTS、结构分辨率极高的LiP-MS和基于热稳定性的技术如细胞热位移分析CETSA、全蛋白质组扩展版TPP、以及效率极高的PISA。▶优势适用范围极广完美保留化合物天然活性。能兼容微量成分甚至中药复方生理相关性强样本消耗极低。▶局限属于间接推断容易受到蛋白翻译后修饰或下游信号通路的干扰而产生假阳性且对后期数据解读、统计算法要求较高。为了方便大家对比丸子给大家整理了表格评估维度标记法非标记法核心技术生物素Pull-down、Strep-tag 捕获、光亲和标记 (PAL) 结合点击化学CETSA、TPP、DARTS、LiP-MS、SPROX化学修饰必须修饰。极度依赖已知构效关系SAR存在破坏活性及靶点漂移的高风险。完全无需修饰。完美保留化合物天然空间结构、理化性质及原始活性。结合验证直接性极高。基于确凿的物理富集大幅屏蔽信号传导产生的背景干扰。复杂度高。通过监测热力学或水解动力学间接推断完整细胞内易受次级生物学效应干扰。生理相关性中等偏低。大多在细胞裂解液中进行。极高。可直接部署于完整活细胞甚至原代组织囊括蛋白复合物与辅因子影响。成分适用性极差。需要毫克级别以上的高度纯化单体用于多步有机合成与表征验证。极佳。无缝兼容微克级稀有成分、复杂粗提物乃至传统中药复方的整体性靶点筛选。结合位点3D解析有限支持。PAL 结合质谱可大致定位交联氨基酸但依赖光敏基团覆盖范围。深度支持。LiP-MS与SPROX能够精准提供多肽分辨率的变构或直接结合位点图谱。那么非标记法一定比标记法好吗显然不是。技术本身没有绝对的优劣关键在于匹配课题阶段与研究目标。二、如何根据课题现状选对技术方案标记法与非标记法从来不是二选一的对立关系而是构成了从假设生成到严谨确证的完整闭环。为了让大家能直接落地执行我们针对中药及天然产物研究中最常见的四类场景匹配了最优实验策略场景一手握新骨架/极微量活性成分构效关系完全未知▶研究痛点样品极为珍贵如罕见微生物次级代谢产物且完全不清楚构效关系。贸然进行探针合成极易导致活性丧失或靶点漂移前期投入打水漂。▶最优策略TPP-PISA高通量初筛DARTS/CETSA正交验证。▶执行逻辑①首先利用PISA技术进行全蛋白质组初筛。PISA通过合并不同温度点的样本能把传统TPP的10次质谱进样压缩为1次大幅节省样本非常适合稀缺样品的“盲盒式”扫描。②锁定排名靠前的候选蛋白后使用门槛低、操作简便的DARTS技术在体外进行正交验证。只需将化合物与细胞裂解液孵育加入蛋白酶进行可控酶解通过免疫印迹观察降解差异即可初步确认结合。▶避坑提示对于新骨架成分切忌一上来就砸钱做探针合成。利用非标记方法以低成本、低消耗完成靶点发现到验证的闭环才是性价比之选。场景二已知构效关系的“明星单体”需冲击顶刊解析精细机制▶研究痛点研究全合成/半合成工艺成熟、药效明确的中药单体课题已进入深度机制解析阶段。为了冲击高质量期刊不仅需要活细胞内直接结合的“实锤”还要精确解析结合区域与别构调控机制。▶最优策略双功能光亲和探针PALLiP-MS三维映射。▶执行逻辑①第一步基于清晰的构效关系在不影响活性的位点合成双功能光亲和探针并在活细胞内完成靶蛋白交联与富集。这能为你提供顶级期刊高度认可的活细胞内直接结合证据排除了间接作用干扰。②第二步锁定靶点后应用LiP-MS技术进行精细结构解析。对比给药组与对照组的半胰酶切肽段丰度差异精准定位药物结合保护肽段与别构效应区域为分子级别的结构改造提供导航。▶避坑提示前提是一定要选对修饰位点。若对活性位点判断不准务必先做简单的基团修饰预实验来验证活性。场景三研究中药复方/粗提物需评价多靶点网络与脱靶毒性▶研究痛点研究对象是复方、粗提物或多靶点活性成分单一靶点无法解释整体药效同时需要筛查潜在肝肾毒性相关的脱靶蛋白。此时标记法完全无法适用。▶最优策略活细胞模型中的高分辨TPP组学。▶执行逻辑在生理相关的活细胞系中开展TPP实验结合TMT同位素定量标记。这种全局视角不仅能捕捉直接结合靶标还能观测到药物进入细胞后引发的下游通路激活等“波纹效应”。它完兼容复杂混合物体系能够完整呈现多靶点协同作用的网络并系统筛查脱靶毒性蛋白。▶避坑提示TPP给出的是全局状态变化必须注意区分直接靶点与间接效应后续挑选核心节点蛋白需进行正交实验验证。场景四生信分析/分子对接完成需要低成本反向验证▶研究痛点已经通过网络药理学或分子对接获得了预测靶点急需高效的生化/细胞实验排除假阳性为文章补充说服力强的实验证据。▶最优策略等温剂量反应指纹图谱ITDRF-CETSA或NanoBRET实时监测。▶执行逻辑普适性最强的是ITDRF-CETSA。在特定温度下通过WesternBlot定量检测上清中可溶性靶蛋白随药物浓度梯度的变化如果发生梯度回升便是靶标啮合的经典判据。该方法仅需常规分子生物学设备即可开展。若预算充足且追求高通量与动力学数据可构建NanoBRET探针体系在活细胞内实时定量监测。▶避坑提示千万不要把分子对接结果直接作为最终结论补上细胞水平的结合验证文章的严谨性将得到质的飞跃。总结非标记技术打破了化学合成的门槛让结构复杂、易失活的天然产物第一次能够在活细胞、全蛋白质组尺度上展现真实的作用图谱而标记技术则始终是过滤生物学噪音、提供物理结合“硬证据”的坚实底座。做中药靶点研究单一维度的证据永远是脆弱的。只有多维度、跨尺度的证据链深度融合我们才能真正揭开中药作用机制的黑匣子推动中药原始创新走向现代临床。对于很多课题组和博士生而言真正落地这套多维度的验证体系往往面临着仪器门槛高、实验周期长、生信分析数据庞杂等现实挑战。为了帮助广大科研人员打破技术壁垒以最高的性价比和最快的速度推进课题谱度众合重磅推出了“中药靶点及作用机制研究一站式解决方案”。该方案专为解决天然产物及中药研究而生只需3万元的普惠经费与1个月的极致周期即可为您提供涵盖中科院2区文章90%工作量的高质量数据支撑⬇️⬇️⬇️中药靶点及作用机制研究一站式解决方案▶ 快速发文项目周期仅需1个月报告内容参照SCI格式提供符合论文发表要求的图表以及中英文结果描述从实验设计阶段开始最快可在4个月见刊。▶保障阳性结果采用基于高通量无偏见筛选的数据驱动实验策略与传统的假设驱动的实验策略相比无需预设特定的靶标分子可以直接筛选出潜在的药物结合靶点从而有效避免了出现阴性结果的风险。▶结果图表丰富高通量组学结果联合多个数据库深入分析中药活性成分、作用靶点、功能富集通路、分子对接、蛋白质相互作用等多层面的结果包含7大分析模块25项分析内容交付4张核心组图报告数据结果能达到中科院2区文章90%的工作量标准。▶杂志接受度高从自身课题现象出发采集实验材料采用以高通量筛选技术获得关键靶标及通路的实验性研究相比于仅依靠数据库挖掘的方法更易受到学术杂志的认可。▶无科研诚信风险质谱高通量筛选产生信息庞大又相互关联的数据结果从原始数据到分析数据的整个过程我们将以文件夹清晰完整地交付给客户以便用于论文发表和数据上传从而杜绝项目数据造假的可能。参考资料1. Elsässer F, de Souza N, Picotti P. 3D proteomics: structural, functional, chemical and biomarker discovery proteomics with LiP-MS. Mol Cell Proteomics. 2026;25(6):101552.2. Sanchez TW, Ronzetti MH, Owens AE, et al. A real-time cellular thermal shift assay (RT-CETSA) to monitor target engagement. bioRxiv. Preprint posted January 27, 2022.3. Nagel L, Grossbach J, Cappelletti V, Dörig C, Picotti P, Beyer A. Analysis of limited proteolysis-coupled mass spectrometry data. Mol Cell Proteomics. 2025;24(4):100934.4. Murai M, Miyoshi H. Photoaffinity labeling of respiratory complex I in bovine heart submitochondrial particles by photoreactive [125I]amilorides. Bio Protoc. 2020;10(14):e3669.5. Tolvanen TA. Current advances in CETSA. Front Mol Biosci. 2022;9:866764.6. Jiang X, Shon K, Li X, et al. Recent advances in identifying protein targets of bioactive natural products. Heliyon. 2024;10(15):e33917.7. Seo SY, Corson TW. Small molecule target identification using photo-affinity chromatography. Methods Enzymol. 2020;633:1-25.8. Zhu Y, Zhang J, Tu P, Zeng K, Wang L. Recent advances in the target identification strategies of natural products: an overview from 2014 to 2025. Targetome. 2026;2(2):e015.
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